Ilusionado con sus investigaciones históricas en el laboratorio fisiológico de Ernst von Brücke, dilató su cualificación médica hasta 1881. Siempre había estado más interesado por los seres humanos y los problemas de la cultura que por el mundo material, pero estaba persuadido de la necesidad de la disciplina estricta del adiestramiento técnico. No tenía aptitudes para las ciencias física y matemática, y su trabajo de investigación estaba limitado a la aclaración microscópica de varios tramos del sistema nervioso central, ya que ahí residía el fundamento de la teoría neuronal. Esta investigación continuó después de su graduación en medicina, pero, cuando se enamoró en 1882, se dio cuenta de que si quería casarse tendría que adoptar una carrera más práctica y, de acuerdo con esto, pasó dos años como médico ayudante en el Hospital General de Viena. Durante este tiempo realizó un estudio minucioso sobre la cocaína y fue el primero en descubrir sus importantes cualidades anestésicas.

En 1882, un viejo colega, el doctor Josef Breuer, le habló a Freud de una paciente, «Anna O», que se había beneficiado del método «catártico» para revivir olvidados recuerdos dolorosos mientras se hallaba en estado de hipnosis. En el período 1885-86 Freud estudió durante tres meses con el doctor Jean Martin Charcot en el Hospital de la Salpêtrière de París, pero no pudo interesar al médico en los descubrimientos de Breuer. Sin embargo, su visita a la Salpêtrière fue para él decisiva, ya que aprendió a ver la histeria como un interesante problema merecedor de una seria investigación.

Al volver a Viena instaló una consulta privada como neurólogo y al fin se vio financieramente con posibilidades de casarse. El matrimonio fue feliz y dio como fruto seis hijos; uno de éstos, Anna, y un nieto, W. Ernst Freud, seguirían más tarde la carrera de psicoanalistas. Durante unos pocos años estuvo Freud en una clínica pediátrica, donde se distinguió con la publicación de dos libros clásicos sobre una forma de parálisis infantil que llegó a ser conocida por su nombre. También escribió en 1891 un importante libro sobre la afasia.

Los primeros años de experiencia clínica de Freud están expresados en Studien über Hysterie (Estudios sobre la histeria, 1895), un libro escrito en colaboración con Breuer. Pero Freud había empezado ya a reemplazar el método hipnótico por uno de su invención conocido como libre asociación, la base del posterior método psicoanalítico; en éste el paciente relaja su atención consciente y relata sencillamente sus pensamientos tal como se producen. El perfeccionamiento del método psicoanalítico ocupó a Freud desde 1895 hasta 1900 y en esos años realizó buena parte de sus descubrimientos fundamentales.

Sus publicaciones de ese período, referentes principalmente al origen sexual de las psiconeurosis, fueron acogidos con ironía y sólo tuvo un amigo que lo trató con simpatía, un médico berlinés llamado Fliess; las cartas de Freud y las memorias de Fliess, luego publicadas con el título de Grundzüge der Psychoanalyse (Rasgos fundamentales del psicoanálisis), dan un cuadro vivo de sus luchas de aquellos años. En 1899 publicó lo que se considera su obra magna, Die Traumdeutung (La interpretación de los sueños); trata ésta, no sólo de los problemas de ensamblaje de la vida onírica y de los complejos mecanismos mentales que trabajan en la elaboración de los sueños, sino también de la estructura y funcionamiento de las capas más profundas de la mente normal, el inconsciente. Su más importante contribución a este conocimiento fue su detallado estudio de lo que él llamó los sistemas mentales primario y secundario.

En 1902 Freud invitó a unos pocos discípulos a reunirse regularmente para estudiar su trabajo. Este pequeño grupo se convirtió en la Sociedad Psicoanalista de Viena. En 1904 publicó Zur Psychopathologie des Alltagslebens (Psicopatología de la vida cotidiana), un estudio de las muchas formas de funcionamiento mental imperfecto, tales como los fallos de memoria, dislalias y otros defectos del habla. Al año siguiente publicó Drei Abhandlungen zur Sexualtheorie (Tres ensayos sobre la teoría sexual), en los que explica la significación de la sexualidad infantil.

En 1906, varios psiquiatras suizos, encabezados por Eugen Bleuler y Carl G. Jung, se unieron a Freud. Dos años más tarde se celebraría el primer Congreso Internacional de Psicoanálisis; asistieron a él 42 seguidores de Freud, entre ellos Karl Abraham, Sandor Ferenczi y Ernest Jones. En 1911 Alfred Adler, en 1912 Wilhelm Stekel y en 1914 Jung, abandonaron a Freud a causa de diferencias personales y científicas. En 1913 publicó Totem und Tabu (Tótem y tabú), que sucede en importancia sólo a La interpretación de los sueños; en el libro se pone de relieve la significación psicológica e histórica de los deseos parricidas en el ser humano. En 1915 publicó una serie de ensayos fundamentales sobre la teoría de la mente.